پژوهش / تست آزمایشگاهی 95752

این پروژه دانش امپزی که خدمتتون میفرستم رو لطفا قیمت و مدت زمان انجامش رو بفرمایید عنوان پروژه: عنوان طرح: بررسی اثر عصاره سه گیاه بومی شهرستان دماوند ؛ ریشه کاسنی (Cichorium intybus )، برگ آویشن (Thymus vulgaris‌) و تخم گشنیز (Coriandrum sativum) بر تنظیم نرمال فلور لوله گوارش نرم افزار: ورد توضیح پروژه: اثر مجموع سه عصاره کاسنی، گشنیز و اویشن رو بر روی باکتری مضر ایکولای و باکتری مفید لاکتوباسیلوس که در فلور طبیعی دستگاه گوارش وجود دارد مورد بررسی قرار خواهد گرفت، انتظار داریم اویشن به دلیل خواص ضد باکتریایی اثر کنترل کنندگی روی باکتری ایکولای داشته باشد و کاسنی به دلیل داشتن ابنولین اثر مثبت روی باکتریهای پروبیوتیک مثل لاکتوباسیلوس و همچنین گشنیز که اثرات ضد نفخ دارد مهلت پروژه هرچه زودتر بهتر یک یا نهایتا دو هفته برای ما بسیار عالی خواهد بود رشته تحصیلی بچه ها، علوم تجربی است نه نه فقط چند تا تست ازمایشگاهی هست، توی پروپوزالی که خدمتتون فرستادم ازمایشاتی مه لازمه انجام بشه نوشته شده توی ویسی هم که باز نشد توضیح داده بودم خدمتتون که عصاره رو خود بچه ها میگیرند و خدمتتون میفرستند داخل پروپوزال تست mtt هم نوشته شده که اگر مقدوره انجام بشه اگر نه مشکلی نیست تستها رو خدمتتون میفرستم اینجا ببینید مه انجام میشه یا نه آماده سازی باکتریها دو گروه باکتری در این آزمایش مورد بررسی قرار میگیرد: سویه استاندارد لاکتوباسیل اسیدوفیلوس PTCC 1643)) سویه استاندارد اشرشیا کلی (PTCC 1399) ابتدا این سویهها تهیه شده و در محیط کشت به مدت دو هفته واکشت میشود تا خالص سازی گردد. سپس گروههای آزمایشی را به پنج گروه سه تایی (پنج تیمار در سه تکرار) تقسیم بندی میکنیم که در سه گیاه نیز انجام می شود: گروه اول: غلظت 20 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت) گروه دوم: غلظت 25 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت) گروه سوم: غلظت 30 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت) گروه چهارم: غلظت 35 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت گروه شاهد 1: محیط کشت حاوی باکتریهای اشرشیاکلای در حضور دیسکهای استاندار جنتامایسین (در سه تکرار) برای آزمایش روی ایکولای، گروه شاهد2: محیط کشت حاوی باکتریهای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در حضور دیسکهای استاندارد ونکومایسین (در سه تکرار) برای آزمایش روی لاکتوباسیلوس. ابتدا 18 پلیت حاوی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را در محیط کشت بلاد آگار و 18 پلیت اشرشیاکلی مقاوم به آنتی بیوتیکهای رایج را در محیط کشت EMB آگار تهیه میکنیم که نوع کشت هر دو باکتری، کشت چمنی است. سپس سه عدد از هر کدام از پلیتهای حاوی باکتریها را گروه کنترل قرار میدهیم. در ادامه عصاره گیاه اول را با غلظتهای (20ml،25ml،30ml،35ml) در 100میلی لیتر آب حل میکنیم و جهت اثردهی عصارهها بر روی باکتریها، دیسکهای کاغذی از جنس کاغذ صافی، تهیه می کنیم. روش کار به این صورت است که توسط پانچ به تعداد زیاد یک کاغذ صافی را پانچ کرده و دیسکهای کاغذی از جنس کاغذ صافی تهیه شده توسط اتوکلاو استریل میشود و در ادامه پتریها با 100 میکرولیتر از باکتری مورد آزمایش تلقیح میشود؛ به این صورت که با استفاده از یک سوآپ استریل مقدار مشخصی از باکتری را برداشته و به صورت چمنی روی محیط، کشت میدهیم. وقتی باکتری روی پتریها کشت شد، برای اثر دادن عصارهها روی محیط کشت، در زیر هود، دوزهای مورد نظر از عصارههای آماده را با ذکر رقم روی دیسکهای کاغذی تهیه شده ریخته و اجازه میدهیم تا در زیر هود خشک شود. در ادامه، دیسکهای کاغذ فیلتر که حاوی عصاره خشک شده بودند روی سطح محیط کشت پلیتهای حاوی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس قرار داده شده و تحت شرایط مناسب در انکوباتور قرار داده میشود. عامل ضد میکروبی (عصارهها) در آگار پخش شده و مانع جوانه زنی و رشد میکروارگانیسم مورد آزمایش میگردد. سپس از نظر قطر هاله بعد از 24، 48 و 72 ساعت مطابق استاندارد CLSI با استفاده از خط کش مورد بررسی و اندازهگیری قرار می گیرد و اثر ضد باکتریایی هر عصاره با مشاهده اندازه هاله عدم رشد مورد تفسیر قرار میگیرد. این روش برای هر دو باکتری و عصاره سه گیاه به صورت جداگانه انجام می شود و موثرترین غلظت برای هر عصاره به دست میآید. در مرحله بعد، پنج گروه آزمایشی با سه تکرار خواهیم داشت: گروه آزمایشی اول: موثرترین غلظت از تخم گشنیز و آویشن (در سه تکرار) گروه آزمایشی دوم : موثرترین غلظت تخم گشنیز و کاسنی (در سه تکرار) گروه آزمایشی سوم: موثرترین غلظت آویشن و کاسنی (در سه تکرار) گروه آزمایشی چهارم: موثرترین غلظت آویشن و کاسنی و تخم گشنیز (در سه تکرار) گروه شاهد : کشت باکتری ها بدون حضور عصاره، افزودن آب مقطر به جای عصاره (در سه تکرار) با اضافه کردن موثرترین غلظتهای هر گیاه دو به دو (تخم گشنیز و آویشن، تخم گشنیز و کاسنی، آویشن و کاسنی) و در آخر سه عصاره را با هم ترکیب میکنیم و به روش قبل به پلیتها اضافه میکنیم و میزان رشد و تکثیر باکتریهای درون پلیت با حضور دیسکهای حاوی ترکیب عصاره ها بررسی و مقایسه میکنیم تا بهترین ترکیب از همهی ترکیب ها مشخص شود . آزمون دی متیل تیازول دی‌فنیل تترازولیوم بروماید یا MTT Assay پس از تعیین بهترین دوز و بهترین ترکیب از مجموع عصاره ها، بررسی میزان سمیت این عصاره ها بر روی باکتری مفید لاکتوباسیل اسیدوفیلوس به روش MTT انجام خواهد شد. ابتدا 104×1 باکتری به همراه 100 میکرولیتر محیط کشت درون هر چاهک پلیت کشت سلولی 96 چاهکی ریخته شده و سپس به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار خواهد گرفت. سپس محیط کشت روی سلول‌ها تا حد امکان خارج کرده و 100 میکرولیتر از غلظتهای آماده شده از هر ماده به هر چاهک کشت افزوده شد و باکتریها برای مدت 24 ساعت دیگر در مجاورت ماده با غلظتهای مشخص قرار گرفتند. پس از آن محیط کشت خارج شده و 100 میکرولیتر MTT با غلظت 5/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در هر چاهک ریخته خواهد شد و به مدت 4 ساعت درانکوباتور قرار خواهدگرفت. پس از گذشت 4 ساعت محلول روی باکتریها خارج خواهد شد و ایزوپروپانول به آن‌ها اضافه گردیده تا بلورهای بنفش رنگ ایجاد شده حل شوند. برای حل شدن بهتر رسوب MTT، پلیت به مدت 15 دقیقه بر روی دستگاه شیکر قرار خواهدگرفت. سپس مقدار غلظت ماده حل شده در ایزوپروپانول با استفاده از دستگاه الایزاریدر (STAT FAX 2100, USA) در طول موج 545 نانومتر محاسبه خواهد شد. چاهک دارای باکتریهای بیشتر چگالی نوری (OD) بالاتری نسبت به چاهک با باکتری کمتر نشان می‌دهد. بنابراین می‌توان از رابطه زیر چاهک دارای مقدار باکتری بیشتر را مشخص کرد و با نمونه شاهد مقایسه نمود. 4550