پروژه آزمایشگاهی میکروبیولوژی..

- رشته ام میکروبیولوژی - انجام کارهای آزمایشگاهی پایان نامه ارشد (فقط کارهای ازمایشگاهی) - عصاره گیری، سنتز نانولیپوزوم، مشخصه یابی نانولیپوزوم های سنتز شده،بررسی شکل و ساختار نانولیپوزوم ها با میکروسکوپSEM، اندازه گیری پتانسیل زتا با دستگاه زتاسایزر، بررسی سایز نانولیپوزوم ها با dls, کشت باکتری و بررسی انها به روش mic , mbc - درضمن ما 3 نفر هستیم و کارمون وجه اشتراک داره - 2 نفرمون گیاه مشابه داریم و 2 نفر باکتری مشابه - عصاره گیری: گیاه  از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه می شود. به منظور استخراج عصاره آبی، گیاه به صورت خشک شده و پودر شده تهیه خواهد شد. برای اینکار گیاه پودر شده با آب مقطر )نسبت 1 به 10 )در دمای 80 درجه سانتی گراد مخلوط می شود و روی بن ماری با دمای80 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه قرار می گیرد . بعد از طی کردن این مراحل عصاره بدست آمده در دمای محیط خنک و صاف می شود . عصاره آبی تهیه شده بالافاصله در آزمایش ها استفاده می شود و در اگر توقفی در کار صورت گیرد تا زمان استفاده در یخچال با دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری خواهد شد )14 سنتز نانولیپوزوم: لیپوزوم های حاوی عصاره گیاه به روش آب پوشانی لایه نازک و با ترکیبی شامل Phosphatidylcholine (SPC) ، کلسترول ، پلی اتیلن گلیکول و عصاره گیاه  تهیه می گردد، که خلاصه آن به شرح زیر است: ابتدا SPC، کلسترول و عصاره  در حلال کلروفرم و در دمای 45 درجه سانتی گراد بر روی روتاری حل می شود و تحت شرایط خلأ ، فیلم نازک خشک تهیه می گردد. بعد از آن عمل هیدراته کردن با افزودن بافرPBS  طی مدت یک ساعت و در دمای 50 درجه سانتی گراد انجام می گردد. سپس نانوذرات تهیه شده با استفاده از سونیکیت حمامی برای مدت 60 دقیقه کاهش سایز داده می شود (10). مشخصه یابی نانو لیپوزوم های سنتز شده: ویژگی های فیزیکوشیمیایی نانولیپوزوم های سنتز شده شامل: اندازه و پتانسیل زتا، مقدار عصاره بارگذاری شده، مورفولوژی مورد تفحص قرار می گیرد (7) بررسی شکل و ساختار: یک قطره از نمونه مورد نظر که حاوی نانولیپوزوم دارای عصاره است را روی لام خواهیم ریخت و پس از خشک شدن آن را زیر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) جهت تایید نتایج حاصل از DLS  بررسی خواهیم کرد (15). تعیین پتانسیل زتا: پتانسیل زتا شاخصی برای میزان برهم کنش دافعه بین ذرات کلوئیدی است و برای ارزیابی پایداری سوسپانسیون هاو محلول های وزیکولی استفاده می شود (16). میزان بار سطحی و پتانسیل زتای نانولیپوزوم های حامل عصاره گیاه  با کمک دستگاه زتا سایزر در دمای 25 درجه سانتی گراد اندازه گیری خواهیم کرد (10). بررسی سایز: برای تعیین توزیع ذرات موجود در محلول ها و سوسپانسیون از روش فیزیکی پراکندگی نور دینامیکی برای تعیین توزیع ذرات موجود در محلول ها و سوسپانسیون استفاده می شود. برای تعیین اندازه ذرات در محدوده چند نانومتر تا میکرون می توان از این روش استفاده کرد که روشی غیر مخرب و سریع می باشد. اخیرا نشان داده شده است که، ذراتی قطرآن ها از نانومتر نیز کم تر است می توان با این روش آن ها را اندازه گیری نمود. این روش وابسته  به برهم کنش نور با ذره می باشد. نور پراکنده شده توسط نانو ذرات موجود در سوسپانسیون با زمان تغییر می کند که می تواند به قطر ذره ارتباط داده شود (17). بررسی خاصیت آنتی باکتریال نانولیپوزوم های حاوی عصاره گیاه  با روش MIC   وMBC  : تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) عصاره گیاه  به روش میکرودایلوشن براث و حداقل غلظت کشندگی (MBC) عصاره گیاه  نیز به وسیله ی تست سریال رقت MIC  و از طریق کشت دادن روی پلیت آگار انجام می گردد (18). برای تعیین این غلظت از روش رقت سازی در پلیت 96 خانه استفاده خواهد شد. بدین منظورمحلول استوک اولیه از ماده ی مورد بررسی مان را با استفاده از محیط کشت نوترینت براث تهیه خواهد شد. سری رقتی از نمونه های نانولیپوزوم و عصاره در نوترینت براث تهیه خواهیم کرد. سوسپانسیونی از کشت تازه باکتری دهانی در سرم فیزیولوژی تهیه و کدورت آن ها با لوله ی نیم مک فارلند تنظیم خواهیم کرد. این سوسپانسیون با نوترینت براث رقیق خواهند شد و پس از آن به هر چاهک اضافه خواهیم کرد. پس از گرمخانه گذاری، چاهک ها را از لحاظ داشتن کدورت بررسی خواهیم کرد و اولین چاهکی که کدورتی در آن نباشد به عنوان کمترین غلظت مهار کنندهی رشد، نامیده خواهد شد. سپس از هر یک غلظت های پایین تر ازMIC  بر خواهیم داشت و و در پلیت های دارای محیط کشت، کشت سطحی انجام می دهیم و به مدت 24 ساعت در انکوباتور در دمای 37درجه سانتی گراد قرار داده خواهد شد. سپس رشد و عدم رشد باکتری ها بررسی شد، اولین غلظتی که در آن عدم رشد مشاهده گردید به عنوان  MBC در نظر خواهیم گرفت (12).